Pintando el cerebro (2/2): más allá del arcoiris

¿Qué tiene que ver una medusa con el cerebro humano? Si lees el texto en vez de mirar sólo las fotitos, lo entenderás.

 En la primera parte de este repaso a las técnicas que propiciaron el desarrollo de la neurociencia, pudimos ver cómo los trabajos de Ramón y Cajal y Golgi (recuerden: son dos personas, no tres) les valieron un Nobel conjunto, suponiendo un paso de gigante en el campo de estudio del sistema nervioso. Sin embargo, en ciencia pocas veces se zanjan las cuestiones. Aquello sólo supuso disponer de mayor información para desarrollar nuevas hipótesis y dirigir nuevos experimentos. De hecho, como bien se mencionó en un comentario del anterior post, ni siquiera ante esta abrumadora evidencia de la división neuronal de todo el sistema que permitía la tinción de Golgi, los dos genios pudieron ponerse de acuerdo en el funcionamiento y organización del cerebro. Aunque la célula nerviosa se perfilaba como la unidad funcional básica en el tejido cerebral, la manera en que los distintos tipos celulares se conectaban y transmitían la información estaba lejos de ser comprendido.  

Saltamos hasta el año 2007. La biología molecular se ha establecido como una disciplina con entidad propia, con la que disponemos de herramientas increíbles para desentrañar los mecanismos internos de las células. Una de estas herramientas son las proteínas fluorescentes. El origen de estas útiles proteínas se encuentra una vez más en organismos de nuestro planeta, en este caso una especie de medusa de bellos colores y capaz de emitir este tipo de luz. Cuando se consiguió aislar la proteína responsable de esta luminiscencia (denominada GFP, del inglés Green Fluorescent Protein) enseguida se entendió que podría constituir una «etiqueta» marcadora de gran utilidad. Mediante ingeniería genética, los genes que codifican para la proteína fluorescente se puede «enganchar» al gen que deseemos, e introducir el producto resultante de la traducción de ese combinado de genes (nuestra proteína favorita con un trocito que brilla) en determinada célula para estudiar las propiedades de la proteína como su localización, interacción con otras proteínas, o si lo hacemos a escala más amplia, para observar cómo se asocian las células en un determinado tejido. Se consigue así trazar la trayectoria de una misma estirpe celular, pues si introducimos el gen de la proteína en una única célula y esta se divide sucesivamente, finalmente encontraremos una población totalmente fluorescente.

Aunque pueda parecer una lámpara de habitación infantil, esto es una placa de Petri donde han crecido bacterias a las que se les ha introducido artificialmente diferentes genes que codifican para proteínas fluorescentes.

Un desarrollo de esta última idea fue lo que dio origen al hito que comentamos hoy. La idea de los investigadores que desarrollaron esta reciente técnica que contraponemos a la antigua metodología de tinción de tejido nervioso fue precisamente utilizar este tipo de proteínas fluorescentes para solventar el problema de la tinción de Golgi, a saber: que sólo se teñía un número muy limitado de neuronas y por tanto no se permitía estudiar las conexiones entre ellas. Pensaron los investigadores que si conseguían que todas las células del cerebro fuesen fluorescentes, tendrían el mismo problema que si no se tiñesen de ninguna manera: ¿para qué quiero ver todas las células verdes, si tendré una maraña de color verde? Estamos en las mismas. Pero, ¿y si lo que hacemos es introducir diferentes colores en las células? Tendremos entonces un cerebro de colorines, donde la conexión entre una neurona y su vecina será fácilmente identificable, al ser cada una de un color. Pero claro, «colorear» las células una a una, es algo imposible. Se necesita una forma de «pintar» las células desde su origen, según se van replicando, y además se necesita que cada una de ellas se tiña de un color distinto, o por lo menos que grupos concretos de células sean de un color diferente de sus vecinas. Pues dieron con la forma de hacerlo, por increíble que parezca.

En primer lugar, debemos comentar que además de la original proteína verde fluorescente, existen otras proteínas muy similares que emiten fluorescencia en diferentes longitudes de onda (esto quiere decir, sencillamente, que emiten luz de distinto color): CFP (azul), YFP (amarilla) o RFP (roja). Y aquí viene la magia: cada proteína equivale a un color; cada proteína proviene de un gen; y resulta que podemos jugar con los genes como nos plazca. Así que estos investigadores decidieron crear diversas combinaciones génicas, que diferían tanto en el tipo de proteína fluorescente como en el número de repeticiones del gen que codificaba cada una de ellas. Así se obtuvieron lo que se llaman «construcciones» génicas que producían distintas coloraciones. Pero el remate fue concebir una manera de introducir estas combinaciones génicas en células y conseguir que cada una de ellas contuviese una coloración propia y particular. 

Se consiguió esta meta mediante la utilización de otra estrategia que de nuevo se da en la naturaleza de todos los seres vivos: el fenómeno de recombinación. Este proceso, mediante el cual los cromosomas intercambian material genético con  sus homólogos durante la meiosis, consiste en que hebras de ADN se entrecruzan y son capaces de intercambiar material. En este proceso participan proteínas con actividad enzimática llamadas recombinasa y ligasa, encargadas de cortar las cadenas de ADN justo por el punto donde se cruzan, y posteriormente de «atar» los extremos que han quedado sueltos. Otro gran hito en la historia de la biología molecular fue precisamente utilizar este fenómeno de manera dirigida, a la carta, para poder elegir qué trozos concretos de ADN podían ser eliminados gracias a la actividad de dichas enzimas. De nuevo es tan fácil como jugar con las secuencias: la recombinación se produce a partir de cierta secuencia de nucleótidos, por tanto podemos colocar dicha secuencia flanqueando un gen concreto, activar la recombinasa y la ligasa, y voilà, gen eliminado.

Esquema de generación de un organismo con un gen eliminado por recombinación. Las secuencias LoxP que flanquean el gen «objetivo» sólo se combinan en presencia de la proteína recombinasa Cre. En dicho caso, se produce la eliminación del gen y en su lugar se traduce una proteína insertada artificialmente, como la GFP. La activación de la proteína Cre se puede dirigir, de manera que escogemos el tipo celular donde se va a producir la eliminación del gen así como el momento preciso. Estos tejidos expresarán GFP y serán, por tanto, de color verde.

Las construcciones de proteínas fluorescentes que hemos mencionado más arriba contenían estas secuencias, para producir aleatoriamente determinadas combinaciones de proteínas fluorescentes, como hemos dicho, difiriendo en número de copias y de tipos de colores. Para rematar la faena, no se limitaron a utilizar estos constructos en células de cultivo: los introdujeron en embriones de ratón, obteniendo una colección de hasta 100 colores distintos gracias a los procesos de recombinación y las diferentes copias de proteínas fluorescentes introducidas. Todo ello, en el tejido nervioso de un ratoncito vivo. 

Ejemplo de constructo con tres tipos de proteínas fluorescentes consecutivas: roja, amarilla y azul. Según si se produce recombinación o no, y cuáles son las secuencias LoxP que complementen, obtendremos la expresión de una única proteína (sólo se expresa la primera de las tres, y además en los dos casos últimos se elimina uno o dos de los genes). Vamos, que la célula puede teñirse de rojo, de amarillo o de azul.

Además de la aleatoriedad producida en cada cosntructo según el esquema anterior, se introducen varias copias del constructo en cada célula, por lo que se aumenta la diversidad de colores posibles (en este ejemplo, se obtienen 9 colores distintos resultado de mezclar tres copias con azul, rojo y amarillo en distintas proporciones).

El resultado es espectacular. Se consigue pintar las células con una combinación aleatoria de colores que permite distinguir células individuales, sus conexiones, incluso trazar el recorrido de algunos axones que abarcan porciones de cerebro increíblemente grandes. La maraña homogénea, al estar pintada «a trozos», se puede estudiar desde una perspectiva inédita hasta el momento. Y al igual que sucedió cuando Golgi descubrió su manera de pintar las células, una nueva generación de investigadores pueden ahora pasar horas y horas estudiando la estructura y las conexiones neuronales en los cerebros de distintos organismos. Lo cual no significa que la tinción de Golgi haya quedado desfasada y en desuso; nada más lejos de la realidad. La ciencia se construye a base de avances y mejoras en las técnicas existentes, pero siempre son todas complementarias. En las imágenes de abajo se puede observar el precioso espectáculo de miles de neuronas coloreadas aleatoriamente, permitiendo visualizar las estructuras cerebrales como si se hubieran pintado pacientemente utilizando una paleta con los colores del arco iris, y de ahí el nombre que ha recibido esta técnica: brainbow, un nombre tan ingenioso como el desarrollo de la propia metodología y que implica un juego de palabras intraducible a nuestra lengua (mezclando las palabras inglesas brain y rainbow, cerebro y arcoiris respectivamente).

Pero es evidente que el avance es grandísimo, y como suele suceder, abre más puertas de las que cierra. La posibilidad de reducir la aleatoriedad del proceso mediante activación específica de Cre, además de la aplicabilidad en otros organismos modelo, ya se está poniendo en marcha.

Quisiera terminar esta entrada resaltando cómo en las dos historias comentadas, separadas por largas décadas y un avance tecnológico abismal, se producen unas imágenes sobrecogedoras que rivalizan con cualquier obra de arte diseñada por los mismos cerebros que representan. Son imágenes que podemos admirar durante horas, estéticamente bellas pero que además encierran el misterio de las propias mentes creadoras, demostrando que la ciencia y el arte no sólo no están reñidos sino que se alimentan mutuamente. Sólo conseguiremos avanzar en el conocimiento científico si dejamos volar nuestra imaginación, si seguimos maravillándonos con la belleza, si nos dejamos llevar por nuestro impulso creativo y buscamos la forma de crear algo que nos impresione. Porque admirando la belleza y dejándose llevar por la pasión, es cuando de pronto y sin previo aviso algún cerebro susurra: ¡Eureka!

Carlos Romá Mateo

Gracias a la compañera Canxuki por descubrirme el fantástico mundo del brainbow, inspirando así esta miniserie de entradas.

Referencias:

Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Lu J, Bennis RA, Sanes JR, & Lichtman JW (2007). Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature, 450 (7166), 56-62 PMID: 17972876

Lecturas recomendadas:

Lichtman, Jeff; Jean Livet, & Joshua Sanes (June 2008). «A technicolour approach to the connectome». Nature Reviews Neuroscience 9 (6): 417–422.

Hampel S, Chung P, McKellar CE, Hall D, Looger LL, Simpson JH. (2011) «Drosophila Brainbow: a recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns.» Nat Methods. Mar;8(3):253-9. Epub 2011 Feb 6.

Fuente de las imágenes:

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Dr. Litos